摘要 : 目的 探讨人乳腺珠蛋白 ( hMAM) 、CXC 趋化因子配体 16 ( CXCL16) 及特 异性周 期 蛋 白 D1 ( Cyclin D1) 表 达 水 平在乳腺癌组织表达的临床意义。 方法 选取40 例恶性乳腺癌患者( 试验组) 、40 例良性乳腺癌患者 ( 对照组) 和 40 例健康体检者(正常组) 为研究对象，检测 3 组受试者外周血清中 hMAM mR- NA、CXCL16和 Cyclin D1 水平 。分析 3 种标志物与恶性乳腺癌患者 TNM 分期、 淋巴结转移的相关性，并分析血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平用于 乳腺癌良恶性诊断的有效性 。结果 试 验 组、对照组和正常组的血清 hMAM mRNA 相对表达水平分别为 6. 54 ± 2. 50，4. 27 ± 1. 14 和 1. 00 ± 0. 05，CXCL16 分 别为(71. 14 ± 20. 55) ，( 45. 71 ± 12. 22) 和 ( 13. 99 ± 4. 00) pmol · L－1，Cyclin D1 分别为(60. 91 ± 16. 37) ，(43. 86 ± 12. 12) 和 ( 14. 61 ± 2. 98) U · L－1，两两比较， 差异均有统计学意义 ( 均 P ＜0. 05) 。随着乳腺癌患者的 TNM 分期越高，血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 的表达水平亦逐渐升高 ( 均 P＜0. 05) ; 发生 淋巴结转移的乳腺癌患者的血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 的表达水 平均较未发生淋巴结转移的高(均 P＜0. 05) 。针对患者肿瘤良恶性诊断，血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 的受试者工作曲线下面积分别为 0. 76，0. 84 和 0. 80，最佳临界值分别为 6. 03，58. 66 pmol · L－1 和 53. 21 U · L－1 。结论 血 清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平在与乳腺癌的早期诊断中具有重要 意义，可以有效辅助确定乳腺癌的良恶性。
根据世界卫生组织数据，2020 年全球有 230 万名 妇女被诊断患有乳腺癌，造 成 约 68. 5 万 人 死 亡 [1] 。 尽早筛查和治疗是降低乳腺癌致死率最有效的手段， 因此针对乳腺癌的生物标志物研究非常重要 。人乳 腺珠蛋白 ( human mammaglobin，hMAM) 可特异性地表达于乳腺 组 织 。 CXC 趋 化 因 子 配 体 16 ( C －X －C motif chemokine ligand 16，CXCL16) 是可溶性趋化因 子，在动脉粥样硬化、免疫及炎症相关疾病中被发现。 特异性周期蛋白 D1 ( Cyclin D1) 可以显著地促进细胞 增生 [2] 。本研究旨在探讨血清 hMAM mRNA、CXCL16 及 Cyclin D1 在乳腺癌诊断和治疗中的应用价值。
1 研究设计
本研究按前瞻性、随机、对照、单中心临床试验研 究方法设计。
2 研究对象
纳入 2019 年 1 月至 2021 年 1 月南京市妇幼保健 院收治的 40 例恶性乳腺癌患者(试验组) 、40 例良性 乳腺癌患者(对照组) 和同期的 40 例健康体检者 ( 正 常组) 为研究对象 。本研究经南京市妇幼保健院医学伦理委员会批准(伦理批号 : NTLL20181205A) 。所有 受试者均签署知情同意书。
诊断与入选标准 试验组符合《乳腺癌诊疗规范( 2018 年版) 》[3] 中关于恶性乳腺癌的诊断标准，并经 病理检测确诊 ; 对照组符合《乳腺癌诊疗 规 范 ( 2018 年版) 》[3] 中关于良性乳腺癌的诊断标准，并经病理检 测确定为无浸润和转移能力的 ; 并满足未接受任何形 式的化疗、放疗及免疫治疗者，肿瘤直径≤2. 0 cm 者， 肿瘤无广泛微钙化及多发病灶者，无手术禁忌证，计划采取手术方式治疗者，女性，年龄 ≥ 18 周岁 。正常 组 : ①女性，年龄≥18 周岁 ; ②身体健康。
排除标准 ①合并其他恶性肿瘤者 ; ②其他恶性 肿瘤转移致乳腺癌者 ; ③ 有 重 要 脏 器 功 能 不 全 者 ;
④有认知功能障碍者。
3 试剂与仪器
TRIzol RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧 光定量聚合酶链反应 ( real －time polymerase chain reaction，RT－PCR) 试剂盒，均购自美国 Thermo Fisher 公司 ; 人 CXCL16 和 Cyclin D1 酶联免疫吸附实验 ( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) Kit，均购 自上海 Abcam 公司。
ELx808 酶标仪，美国伯腾公司产品 ; QuantStudio 3 实时定量 PCR 系统，美国 Thermo Fisher 公司产品。
4 试验方法
4. 1 样本采集
采 集 3 组 受 试 者 空 腹 静 脉 血 3. 0 mL ，以 3 000 r ·min －1 离心 10 min 后，收集上清液，置于 4 ℃ 保存，待测。
4. 2 用 RT －PCR 法检测血清中 hMAM mRNA 的
参照卢润豪等 [4] 的方法，用 Qiagen 试剂盒说明书 提取血清中的 RNA 并检测 RNA 的浓度和纯度 。用 逆转录试剂盒将 RNA 转录为 cDNA，随后用定制引物 ( 引 物 序 列 为 TGAACACCGACAGCAGCAG，TCCG- TAGTTGGTTTCTCACC) 进行 hMAM 的实时荧光定量 扩增 。反应体系 25 μL，包含模板 DNA、Taq 聚 合 酶 2. 5 U、10 × 缓 冲 液 和 1. 5 mmol · L －1 MgCl2 、 200 μmol ·L －1 dNTPs、0. 4 μmol · L －1 的正向和反向 引物以及甲酰胺 。 以甘油醛三磷酸脱氢酶 ( glyceral- dehyde 3 －phosphate dehydrogenase，GAPDH) 为内参，用 2 －△△Ct法计算 hMAM mRNA 相对表达水平。
4. 3 用 ELISA 法检测血清中 CXCL16 和 Cyclin D1
参照张诗晗等 [5] 的方法，向已经包埋固定好抗体 的酶标板标孔中加入等量样品，随后加入抗体液，孵 育后通过洗涤液冲洗多次去除未结合的抗体后加入TMB 底 物 显 色，用 酶 标 仪 在 405 nm 处 检 测 光 密 度 ( optical density，OD) 值，然 后 用 标 准 曲 线 计 算 出 CXCL16和 Cyclin D1 的浓度水平。
4. 4 检验血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1
水平用于乳腺癌良恶性诊断的有效性
参照 KUMAR 等 [6] 的方法，用受试者工作特征曲 线(receiver operator characteristic curve，ROC) 评估患 者血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平用于 诊断患者肿瘤良恶性的有效性，通过计算约登指数 ( 灵敏度 + 特异度－ 1) 达到最大所对应的值为最佳诊 断界值的方式计算出患者血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平最佳诊断临界值。
5 统计学处理
用 SPSS 20. 0 软件进行统计分析 。计 量 资 料 用 x-± s表示，组间比较用方差分析，事后分析用 Fisher 最 小显著差检验 ; 计数资料用频数表示，组间比较用 χ2 检验。
1 一般资料
试验组 、对照组和正常组分别 为 筛 选 45 例，47 例和 40 例 。试验组因发现患者合并其 他 肿 瘤 等 原 因脱落 3 例，因为患者已经参加过放化 疗 或 者 免 疫 治疗脱落 2 例，最终有 40 例纳入统计分析 ; 对 照 组 因发现患者合并其他肿瘤脱落 3 例，因 为 患 者 已 经 参加过放化疗或者免疫治疗脱落 3 例，因 患 者 肾 功 能不全脱落 1 例，最终有 40 例纳入统计分 析 ; 正 常组无受试者脱落 。3 组患者的一般资料比较，差 异 均无统计学意义 ( 均 P ＞0 . 05) ，组 间 具 有 可 比 性， 见表 1 。
2 3 组血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水 平比较
试验 组 的 血 清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平均较正常组和对照组明显升高，差异均有统 计学意义(均 P＜0. 05) ，对照组的血清hMAM mRNA、 CXCL16 和 Cyclin D1 水平与正常组比较，差异均有统 计学意义(均 P＜0. 05) 。结果见表 2 。
3 不同临床分期和淋巴结转移情况对恶性乳腺癌患 者血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平的 影响随着乳腺癌患者病理分期的不断升高，乳 腺 癌 患者血 清 hMAM mRNA、Cxcl 16 和 Cyclin D1 水 平 均逐渐 增 加 ( 均 P ＜0 . 05) ; 发生淋巴结转移的乳 腺癌患 者 血 清 hMAM mRNA、CXCL16 和Cyclin D1 水平均明显高于未发生淋巴结转移的 乳 腺 癌 患 者， 差异均有统计学意义 ( 均 P ＜0 . 05) 。结果见表 3 。
4 血清 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 水平 可有效辅助乳腺癌良恶性诊断
针对肿瘤良恶性诊断，血清 hMAM mRNA 的曲线 下面积(area under the curve，AUC) 为 0. 76，95% 置信区 间(confidence interval，CI) 为 0. 64 ~ 0. 87 ( P＜0. 001) ， 最佳临界值为 6. 03 ; CXCL16 的 AUC 为 0. 84，95% CI 为 0. 74 ~ 0. 93 (P＜0. 001) ，最佳临界值为 58. 66 pmol ·L－1 ;Cyclin D1 的 AUC 为 0. 80，95% CI 为 0. 70 ~ 0. 91 ( P＜0. 001) ，最佳临界值为 53. 21 U ·L －1 。
hMAM 蛋白是一种位于染色体 11q12. 3 上 的 乳 腺组织特异性蛋白 。研究表明，hMAM mRNA 在乳腺 癌组织中的表达率非常高 [7] ，但是检测组织中的表达要通过穿刺取样或手术取样，这在乳腺癌的诊断过程 中会给患者带来了明显的生理和心理负担 。作为侵入性较小的检测方法，通过外周血进行液体活检优势 明显 。LEE 等 [8] 研究显示，早期阶段( Ⅰ ~ Ⅱ期) 和晚 期阶 段 ( Ⅲ ~ Ⅳ 期) 乳腺癌患者的外周血 hMAM mRNA的阳性率分别为 23. 4% 和 82. 9% ，差异有统计 学意义(P ＜0. 05) ; 同时，回归分析显示，血浆 hMAM mRNA 的表达水平与患者肿瘤组织学核级高、结节转 移发生情况、雌激素受体和孕激素受体表达水平显著 相关(均 P ＜0. 05) ; 另外，外周血 hMAM mRNA 阴性 的乳腺癌患者的无事件生存率较高(P＜0. 05) 。
CXCL16 位于染色体 17p13 上，除在人体免疫中发 挥重要作用外，还与多种癌症的发生和发展有关 [9] 。
本研究结果显示，CXCL16 在乳腺癌患者血清内的表达 升高，TNM 分期越高其表达水平越高，在发生淋巴结转 移的患者中也明显升高 。邓君等 [10] 研究发现，与良性乳腺疾病和对照组相比，乳腺癌组和其他肿瘤组的外 周血 CXCL16 蛋白表达显著增加，但乳腺癌组和其他肿 瘤组之间差异无统计学意义 ; 在乳腺癌组，CXCL16 蛋 白表达水平与临床分期相关，并在手术后急剧减少。
Cyclin D1 是乳腺癌最为重要的特异性生物标志物， 有50% 左右的患者血清内Cyclin D1 的表达会明显升高， 其水平高低与患者的预后密切相关，是国内外临床预测 乳腺癌患者预后的重要指标[11] 。本研究也发现，在乳腺癌患者血清中 Cyclin D1 水平明显升高，且在发生淋巴结转移的患者中其水平更高。卿笃桔 [12] 证实了乳腺癌患 者外周血淋巴细胞中 Cyclin D1 表达水平与腋窝淋巴结 转移状况和临床分期有关。虽然良性乳腺癌患者血清中 hMAM mRNA、CXCL16 和 Cyclin D1 的水平相比恶性患者 较低，但仍高于健康女性血清中的水平，这充分证实了本 研究中 3 个生物学标志辅助肿瘤诊断筛查的有效性。
本研究结果证实，hMAM mRNA、CXCL16 和Cyclin D1 水平在乳腺癌患者血清中显著升高，且恶性肿瘤 患者与良性肿瘤患者血清中上述标志物水平也存在 显著差异 。此外，3 种外周血标志物水平还与患者的 TNM 分期和是否发生淋巴结转移显著相关，说明这 3 种标志物均可以用于辅助诊断患者肿瘤的发生情况 以及良恶性肿瘤的评估。
张 敏1 ，邵 棋2
